產品名稱：輔酶ⅠNAD(H)含量檢測試劑盒

產品英文名： CoenzymeⅠNAD(H) Content Assay Kit

簡要介紹：
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質三大代謝物質分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環。另外，NAD+降解產物對細胞信號傳導、代謝和基因表達等具有重要的調控作用。

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產品內容： 
酸性提取液：15mL×1 瓶，4℃保存；
堿性提取液：15mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 6mL×1 瓶，4℃保存
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存，用時加入 6.1mL 雙蒸水，混勻，4℃保存一周；
試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時加入 6.6mL 雙蒸水，混勻，4℃保存一周；
試劑五：液體 3mL×1 瓶，4 ℃保存；
試劑六：液體 40mL×1 瓶，4 ℃保存；
試劑七：自備，將 72mL 乙醇和 3mL 蒸餾水充分混合備用。
NAD 標準品：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 1.5mL 蒸餾水，即 2umol/mL，將其稀釋為 1.25nmol/mL 的 NAD 標準溶液備用。
NADH 標準品：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 1.4mL 蒸餾水，即 2umol/mL，將其稀釋為 1.25nmol/mL 的 NAD 標準溶液備用。

操作步驟：
一、NAD+和 NADH 的提取：
1、血清（漿）中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：取 0.1mL 血清（漿），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min (蓋緊，以防止水分 散失)，冰浴冷卻后，10000g 4℃離心 10min；取上清 200uL，加入等體積堿性提取液；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上保存待測。
NADH 的提取：取 0.1mL 血清（漿），加入 0.5mL 堿性提取液，煮沸 5min(蓋緊，以防止水分 散失)，冰浴冷卻后，10000g 4℃離心 10min，取上清 200uL，加入等體積酸性提取液；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上保存待測。
2、組織中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：稱取約 0.1g 組織，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(蓋緊，以防 止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g 4℃離心 10min，取上清 200uL，加入等體積堿性提取液混勻， 10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上保存待測。
NADH 的提取：稱取約 0.1g 組織，加入 0.5mL 堿性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(蓋緊，以防 止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g 4℃離心 10min，取上清 200uL，加入等體積酸性提取液混勻， 10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上保存待測。
3、細胞或細菌中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：收集 500 萬細胞或細菌，加入 0.5mL 酸性提取液，超聲波破碎 1min（強度 20％ 或 200W，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min，取上清液 200uL 另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4℃ 離心 10min，取上清,冰上保存待測。
NADH 的提取：收集 500 萬細胞或細菌，加入 0.5mL 堿性提取液，超聲波破碎 1min（強度 20％ 或 200W，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min，取上清液 200uL 另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4℃ 離心 10min，取上清,冰上保存待測。

二、測定步驟：
1、 分光光度計預熱30分鐘以上，調節波長570nm，蒸餾水調零。
2、 操作表（在1.5ml棕色EP管中按下表依次加樣）

混勻， 570nm 下比色，讀取吸光值ΔA 測定=A 測定管-A 對照管，NAD 標準管的記為ΔA 標準 1=A 標準管 1-A 空白管。 NADH 標準管的記為ΔA 標準 2=A 標準管 2-A 空白管。空白管只需做一 到兩次。

注意事項：
1、操作過程應避光。不可將試劑一、二、三和四混合后再加，必須分開加。
2、反應過程要注意避光。
3、當吸光值大于 1 時，建議稀釋后測量，計算公式中應當乘以稀釋倍數。

NAD+含量的計算 

1. 血清（漿）中 NAD+含量計算

NAD+含量(nmol/mL）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 1÷C 標）×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 測定÷ΔA 標準 1
2、組織、細菌、細胞中 NAD+含量計算
 (1)按樣本蛋白濃度計算
NAD+ (nmol/mg prot）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 1÷C 標）×V 提取÷(V 提取×Cpr) = 1.25×ΔA 測定÷ΔA 標準 1
 (2)按樣本鮮重計算
NAD+ (nmol/g 鮮重）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 1÷C 標）×V 提取÷W= 1.25×ΔA 測定÷ΔA 標準 1÷W
 (3)按細菌或細胞密度計算
NAD+ (nmol/10 4cell）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 1÷C 標）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 測定÷ΔA 標準 1

 NADH 含量的計算

1. 血清（漿）中 NADH 含量計算

NADH 含量(nmol/mL）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 2÷C 標）×V 提取÷V 血清 =12.5×ΔA 測定÷ΔA 標準 2
2、組織中 NADH 含量計算
(1)按樣本蛋白濃度計算
NADH (nmol/mg prot）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 2÷C 標）×V 提取÷(V 樣品×Cpr) = 1.25×ΔA 測定÷ΔA 標準 2
(2)按樣本鮮重計算
NADH (nmol/g 鮮重）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 2÷C 標）×V 提取÷W=1.25×ΔA 測定÷ΔA 標準 2÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
NADH (nmol/10 4cell）=ΔA 測定÷（ΔA 標準 2÷C 標）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 測定÷ΔA 標準 2 C 標：NAD 或 NADH 標準溶液的濃度，1.25nmol/mL；V 提取：加入提取液總體積，1mL；V 血清：提取時加入的血清體積，0.1mL；W：樣本鮮重，g；500：500 萬個細胞。