過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒 微量法說明書
貨號: BC0205 規(guī)格:100T/96S
產(chǎn)品內(nèi)容： 提取液：100mL×1 瓶，4℃保存； 工作液：24mL×1 瓶，4℃保存；
產(chǎn)品簡介： CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是主要的 H2O2清除酶，在活性氧清除系 統(tǒng)中具有重要作用。 H2O2在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能夠分解 H2O2，使反應(yīng)溶液 240nm 下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降，根 據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出 CAT 活性。
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過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒 微量法操作步驟：
一、粗酶液提取： 1、 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ML 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或 細(xì)胞（功率 20%或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒。重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。 2、 血清（漿）樣品：直接檢測。
二、操作步驟 1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 240nm，蒸餾水調(diào)零。 2、 測定前將 CAT 檢測工作液 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴 10min。 3、 加入 10μL 樣本和 190μL 工作液，混勻 5s 或者在酶標(biāo)儀上振動 5s 并立即計(jì)時(shí)，記錄 240nm 下的初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA=A1-A2
三、CAT 活性計(jì)算（用石英比色皿）：
1、 血清（漿）CAT 活力的計(jì)算: 單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/mL）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2消光系數(shù)（43.6×10 -3）×ΔA=459×ΔA
2、 組織 CAT 活力計(jì)算： （1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2消光系數(shù)（43.6×10 -3）×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） =459×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） （2） 按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/g mass）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2 消光系數(shù)（4.36×10 4）×ΔA÷樣本鮮重（g/mL） =459×ΔA÷樣本鮮重（g/mL）
3、 細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算： 單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每分鐘反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/10 4 cell）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2消光系數(shù)（4.36×10 4）×ΔA÷細(xì)胞密度（10 4 cell /mL） =0.917×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 -4L；ε: NADH 摩爾吸光系數(shù)，4.36×10 4L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。W，樣本質(zhì)量，g；Cpr： 上清液蛋白濃度，mg/ml；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。
CAT 活性計(jì)算（用 96 孔板）：
1、 血清（漿）CAT 活力的計(jì)算: 單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/mL）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2消光系數(shù)（4.36×10 4）×ΔA=918×ΔA
2、 組織 CAT 活力計(jì)算： （1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2消光系數(shù)（4.36×10 4）×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） =918×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） （2） 按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/g mass）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2 消光系數(shù)（4.36×10 4）×ΔA÷樣本鮮重（g/mL） =918×ΔA÷樣本鮮重（g/mL）
3、 細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算： 單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每分鐘反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT（U/10 4 cell）＝反應(yīng)總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時(shí)間÷H2O2消光系數(shù)（4.36×10 4）×ΔA÷細(xì)胞密度（10 4 cell /mL） =1.836×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 -4L；ε: NADH 摩爾吸光系數(shù)，4.36×10 4L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。W，樣本質(zhì)量，g；Cpr： 上清液蛋白濃度，mg/ml；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。 1、 預(yù)實(shí)驗(yàn)如果發(fā)現(xiàn)酶活性過高（其實(shí) OD 值過大），可用提取液適當(dāng)稀釋樣品。 2、 如果酶活性過低，延長反應(yīng)時(shí)間（3 分鐘之內(nèi)），并將反應(yīng)時(shí)間準(zhǔn)確代入計(jì)算公式。
一、粗酶液提取： 1、 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ML 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或 細(xì)胞（功率 20%或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒。重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。 2、 血清（漿）樣品：直接檢測。
相關(guān)文獻(xiàn)：
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