產品名稱：NADH氧化酶(NOX)活性檢測試劑盒

產品英文名：NADH Oxidase(NOX) Assay Kit

簡要介紹：
NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應密切相關。NOX能夠將NADH氧化為NAD，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯，藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。

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產品內容
試劑一：液體 25mL×1 瓶，-20℃保存。
試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 0.5mL×1 瓶，-20℃保存。
試劑四：液體 70mL×1 瓶，4℃保存。
試劑五：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 9mL 雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

產品說明
NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，可在氧氣存在下，直接將 NADH 氧化為 NAD。該酶不僅參與 NAD 的再生，而且與免疫反應密切相關。 NOX 能夠將 NADH 氧化為 NAD，NADH 的氧化與 2,6 二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯， 藍色的 DCPIP 被還原為無色的 DCPIP，在 600nm 下測定藍色 DCPIP 的還原速率計算出 NADH 氧化 酶活性的大小。
自備儀器和試劑  可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水

操作步驟
一、樣品測定的準備：
1、 組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
2、 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽 勻漿。
3、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
4、 將上清液移另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
5、 將上清液轉移另一 EP 管中，用于線粒體中泄露 NOX 活性測定。
6、 沉淀即為線粒體，加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，用于 NOX 活性測定。
7、 NOX 總酶活即為上清中 NOX 活性與沉淀中 NOX 活性之和。
二、測定步驟和加樣表：
1、可見分光光度計預熱 30min 以上；
2、試劑四 37℃保溫放置。

將上述試劑按順序在 1mL 玻璃比色皿中操作，加入試劑六后立即混勻，同時開始計時，在 600nm 波長下記錄 20 秒時的初始吸光度 A1，迅速將比色皿連同反應液一起放入 37℃水浴中，準確反應 1 分鐘。迅速取出比色皿并擦干，記錄 1 分 20 秒時的吸光度 A2。計算 ΔA=A1-A2，記錄 A 測定、A 對照，ΔA1=ΔA 上清測定-ΔA 上清對照，ΔA2=ΔA 沉淀測定-ΔA 沉淀對照。
三、NOX 活力單位的計算： 
A、上清中 NOX 活力的計算: 
1、組織中 NOX 活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 蛋白在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V 反總÷(Cpr 上清×V 樣本)=2500×ΔA1÷Cpr 上清

1. 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX（U/g 鮮重）=ΔA1÷0.01×V 反總÷(W÷V 提取×V 樣本)=2525×ΔA1÷W
 2、細菌或培養細胞中 NOX 活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 蛋白在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V 反總÷(Cpr 上清×V 樣本)=2500×ΔA1÷Cpr 上清

1. 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX（U/104 cell）=ΔA1÷0.01×V 反總÷(500÷V 提取×V 樣本)=5.05×ΔA1 V 反總：反應總體積，1mL；V 樣本：加入樣本體積，0.04mL；V 提取：加入提取液體積，1.01mL； Cpr 上清：上清中蛋白濃度，mg/mL；W，樣本鮮重，g；500，細菌或細胞總數，500 萬。

B、沉淀中 NOX 活力的計算:
1、組織中 NOX 活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 蛋白在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V 反總÷(Cpr 沉淀×V 樣本)=2500×ΔA2÷Cpr 沉淀

1. 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX（U/g 鮮重）=ΔA2÷0.01×V 反總÷(W÷V 樣總×V 樣本)=505×ΔA2÷W
2、細菌或培養細胞中 NOX 活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 蛋白在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V 反總÷(Cpr 沉淀×V 樣本)=2500×ΔA2÷Cpr 沉淀
（2）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX（U/104 cell）=ΔA2÷0.01×V 反總÷(500÷V 樣總×V 樣本)=1.01×ΔA2 V 反總：反應總體積，1mL；V 樣本：加入樣本體積，0.04mL；V 樣總：沉淀重懸體積，0.202mL； Cpr 沉淀：沉淀重懸后蛋白濃度，mg/mL；W，樣本鮮重，g；500，細菌或細胞總數，500 萬。

C、樣本 NOX 總活力的計算: 樣本 NOX 總活力即為上清中 NOX 活力與沉淀中 NOX 活力之和。
1、組織中 NOX 活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 蛋白在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/mg prot）=2500×ΔA1÷Cpr 上清+2500×ΔA2÷Cpr 沉淀
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/g 鮮重）=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
2、細菌或培養細胞中 NOX 活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每 mg 蛋白在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/mg prot）=2500×ΔA1÷Cpr 上清+2500×ΔA2÷Cpr 沉淀 （2）按細菌或細胞密度計算： 單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。 NOX（U/104 cell）=5.05×ΔA1+1.01×ΔA2

注意事項
1、粗酶液的提取必須在 0℃- 4℃中操做完成，以防止酶變性失活。
2、比色皿中反應液的溫度保持 37℃，取小燒杯一只裝入一定量的 37℃蒸餾水，將此燒杯放入 37℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
4、實驗時，試劑六樣本在冰上放置，以免變性和失活。

相關文獻：
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