產品名稱：單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性檢測試劑盒
產品英文名： Monodehydroascorbate Reductase (MDHAR) Assay Kit
簡要介紹：
MDHAR 催化 MDHA 還原MDHA 生成 AsA；在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA和NAD＋，NADH在340nm有特征吸收峰，但NAD＋沒有。通過測定340nm光吸收下降速率，來計算MDHAR活性。
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產品內容：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 40mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。
試劑四：液體×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5mL 試劑一充分溶解。
產品說明：
MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。 MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但 是 NAD+沒有。通過測定 340 nm 光吸收下降速率，來計算出 MDHAR 活性。
實驗中所需儀器及設備： 研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調式移液槍和雙蒸水。
操作步驟:
一、粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）1：5-10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（10 4個）：提取液體積（mL）為 500-1000：1 的比例（建議 500 萬 細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲超聲破碎細胞（功率 300w，超聲 3s，間隔 7s，總時間 3min）； 然后 10000rpm，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
二、MDHAR 測定操作：
1. 分光光度計預熱 30 min，調節波長到 340 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑一在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。
3. 依次在石英比色皿中加入下列試劑
| 試劑名稱(μL) |
試劑二 |
試劑三 |
試劑四 |
試劑一 |
蒸餾水 |
上清液 |
| 空白管 |
100 |
100 |
100 |
600 |
100 |
|
| 測定管 |
|
100 |
迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值。分別記為 A1、A2，ΔA=A1-A2，得到 △A 測定、△A 空白。
三、MDHAR 活性計算：
（1）按蛋白濃度計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1μmol NADH 為一個酶活單位。 MDHAR (U/mg prot) = [(△A 測定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總×10 6]÷（Cpr×V 樣）÷T =0.804×(△A 測定管-△A 空白管) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘氧化 1μmol NADH 為 1 一個酶活單位。 MDHAR (U/g 鮮重) =[(△A 測定-△A 空白)÷(ε×d)×V 反總×10 6]÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T =0.804×(△A 測定管-△A 空白管) ÷W
(3)按細胞數量計算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每 10 4個細胞每分鐘氧化 1μmol NADH 為 1 一個酶活單位。 MDHAR (U/10 4 cell) =[ (△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10 6]÷（細胞數量×V 樣÷V 樣總）÷T =0.804×(△A 測定管-△A 空白管) ÷細胞數量
ε：NADH 摩爾消光系數，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；10 6：1mol=1×10 6μmol；V 反 總：反應體系總體積，1mL=0.001 L；V 樣：加入反應體系中上清液體積，100μL=0.1mL；V 樣總： 提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋 白質含量 BCA 試劑盒；W ：樣品質量，g；細胞數量：以 10 4為單位計量，萬個；T：反應時間， 2min
相關文獻:
《Exogenous 24-Epibrassinolide alleviates oxidative damage from copper stress in grape (Vitis vinifera L.) cuttings》 作者:Ya-li Zhou,Su-fang Huo,Li-ting Wang,Jiang-fei Meng,Zhen-wen Zhang,Zhu-mei Xi 期刊:Plant Physiology and Biochemistry 影響因子:3.404 PMID:30099273